Geenien muokkaamisesta proteiinirakenteen määrittämiseen kvanttilaskentaan, tässä on seitsemän tekniikkaa, joilla on todennäköisesti vaikutusta tieteeseen tulevana vuonna.
Täysin valmiit genomit
Noin kymmenesosa ihmisen genomista jäi kartoittamatta, kun genomiikan tutkijat Karen Miga Kalifornian yliopistosta Santa Cruzista ja Adam Phillippy Nationalissa Human Genome Research Institute Bethesdassa, Marylandissa, käynnisti Telomere-to-Telomeren (T2T) -konsortion vuonna 2019. Nyt määrä on pudonnut nollaan. Viime vuoden toukokuussa julkaistussa preprintissä konsortio raportoi ensimmäisen ihmisen genomin päästä päähän -sekvenssin, joka lisää lähes 200 miljoonaa uutta emäsparia laajalti käytettyyn ihmisen konsensusgenomisekvenssiin, joka tunnetaan nimellä GRCh38, ja kirjoitti viimeisen luvun Ihmisgenomiprojekti1.
Vuonna 2013 julkaistu GRCh38 on ollut arvokas työkalu – teline, jolle sekvenssilukemat kartoitetaan. Mutta se on täynnä reikiä. Tämä johtuu suurelta osin siitä, että Illuminan San Diegossa Kaliforniassa kehittämä laajalti käytetty sekvensointitekniikka tuottaa tarkkoja mutta lyhyitä lukuja. Ne eivät ole tarpeeksi pitkiä kartoittaakseen yksiselitteisesti erittäin toistuvia genomisekvenssejä, mukaan lukien kromosomien päät sulkevat telomeerit ja sentromeerit, jotka koordinoivat vastareplikoituneen DNA:n jakautumista solunjakautumisen aikana.
Pitkään luetut sekvensointitekniikat osoittautuivat pelin muuttajaksi. Nämä tekniikat ovat kehittäneet Pacific Biosciences Menlo Parkissa Kaliforniassa ja Oxford Nanopore Technologies (ONT) Oxfordissa, Yhdistyneessä kuningaskunnassa. Nämä tekniikat voivat sekvensoida kymmeniä tai jopa satoja tuhansia emäksiä yhdellä lukukerralla, mutta - ainakin alussa - virheettömästi. . Kun T2T-tiimi rekonstruoi2,3 ensimmäiset yksittäiset kromosominsa – X ja 8 – vuonna 2020, Pacific Biosciencesin sekvensointi oli kuitenkin edistynyt siinä määrin, että T2T-tutkijat pystyivät havaitsemaan pieniä vaihteluita toistuvien sekvenssien pitkissä osuuksissa. Nämä hienovaraiset "sormenjäljet" tekivät pitkistä toistuvista kromosomisegmenteistä selvitettäviä, ja muu genomi osui nopeasti linjaan. ONT-alusta kaappaa myös monia DNA:n modifikaatioita, jotka moduloivat geenien ilmentymistä, ja T2T pystyi kartoittamaan nämä "epigeneettiset tunnisteet" myös genomin laajuisesti4.
Ihmisen täydellisen genomin sulkeminen
Ratkaistu genomi T2T oli peräisin solulinjasta, joka sisältää kaksi identtistä kromosomisarjaa. Normaalit diploidiset ihmisen genomit sisältävät kaksi versiota kustakin kromosomista, ja tutkijat työskentelevät nyt "vaiheistusstrategioiden" parissa, jotka voivat luotettavasti määrittää kunkin sekvenssin sopivaan kromosomikopioon. "Saamme jo melko ilmiömäisiä vaiheistettuja kokoonpanoja", Miga sanoo.
Tämä diploidinen kokoonpanotyö tehdään yhteistyössä T2T:n kumppaniorganisaation, Human Pangenome Reference Consortiumin, kanssa, joka pyrkii tuottamaan edustavamman genomikartan, joka perustuu satoihin luovuttajiin ympäri maailmaa. "Tavoitteenamme on vangita keskimäärin 97 % ihmisen alleelisesta monimuotoisuudesta", sanoo Erich Jarvis, yksi konsortion johtavista tutkijoista ja geneetikko Rockefeller-yliopistosta New Yorkissa. Selkärankaisten genomiprojektin puheenjohtajana Jarvis toivoo myös voivansa hyödyntää näitä täydellisiä genomin kokoamisvalmiuksia luodakseen täydellisiä sekvenssejä jokaiselle maapallon selkärankaiselle. "Luulen, että seuraavien 10 vuoden aikana aiomme tehdä telomeerista telomeeriin genomeja rutiininomaisesti", hän sanoo.
Proteiinin rakenneratkaisut
Rakenne sanelee toiminnan. Mutta sitä voi olla vaikea mitata. Suuret kokeelliset ja laskennalliset edistysaskeleet viimeisen kahden vuoden aikana ovat antaneet tutkijoille täydentäviä työkaluja proteiinirakenteiden määrittämiseen ennennäkemättömällä nopeudella ja resoluutiolla.
Tekoäly mahdollistaa proteiinien laskostumisen ennustamisen
Alphabet-tytäryhtiön DeepMind Lontoossa kehittämä AlphaFold2-rakenteen ennustusalgoritmi perustuu "syväoppimisstrategioihin" laskostetun proteiinin muodon ekstrapoloimiseksi sen aminohapposekvenssistä5. Ratkaiseva voitto 2020 Critical Assessment of Proteiinin rakenneennuste -kilpailussa, jossa laskennalliset biologit testaavat rakenteen ennustusalgoritmejaan suoraan, AlphaFold2:n maine – ja omaksuminen – on noussut huimasti. "Joidenkin rakenteiden osalta ennusteet ovat melkein aavemaisen hyviä", sanoo Janet Thornton, vanhempi tutkija ja entinen Euroopan bioinformatiikkainstituutin johtaja Hinxtonissa, Yhdistyneessä kuningaskunnassa. AlfaFold2:ta on viime heinäkuussa julkaistun julkisen julkaisun jälkeen sovellettu proteomeihin kaikkien ihmisissä6 ja 20 malliorganismissa ilmentyneiden proteiinien rakenteiden määrittämiseksi (katso Nature 595, 635; 2021), sekä lähes 440 000 proteiinia Swiss-Prot-tietokannassa, mikä lisää huomattavasti niiden proteiinien määrää, joista on saatavilla erittäin luotettavaa mallinnustietoa. AlphaFold-algoritmi on myös osoittanut kykynsä torjua moniketjuisia proteiinikomplekseja7.
Samaan aikaan kryogeenielektronimikroskoopin (cryo-EM) parannukset antavat tutkijoille mahdollisuuden ratkaista kokeellisesti haastavimmatkin proteiinit ja kompleksit. Cryo-EM skannaa flash-jäädytettyjä molekyylejä elektronisuihkulla ja tuottaa proteiineista kuvia useissa eri suunnissa, jotka voidaan sitten koota laskennallisesti uudelleen 3D-rakenteeksi. Vuonna 2020 kryo-EM-laitteiston ja -ohjelmiston parannukset mahdollistivat kahden tiimin luomisen alle 1,5 ångströmin erottelukyvyn rakenteilla, jotka mittasivat yksittäisten atomien sijainnin8,9. "Aiemmin tätä käsittelimme termiä "atomiresoluutio" villiin luopumiseen, mutta se on ollut vain lähes atomia", sanoo Bridget Carragher, New Yorkin rakennebiologian keskuksen Simons Electron Microscopy Centerin johtaja New Yorkissa. "Tämä on todella atomista." Ja vaikka molemmat ryhmät käyttivät erityisen hyvin tutkittua malliproteiinia nimeltä apoferritiini, Carragher sanoo, että nämä tutkimukset viittaavat siihen, että lähes atomierottelukyky on mahdollista myös muille, vaikeammille kohteille.\
Monet AlphaFold2:ta alun perin skeptisesti suhtautuvat kokeilijat näkevät sen nyt selkeänä lisänä kokeellisille menetelmille, kuten kryo-EM:lle, jossa sen laskennalliset mallit voivat auttaa tietojen analysoinnissa ja rekonstruoinnissa. Ja kryo-EM voi tuottaa löydöksiä, jotka eivät tällä hetkellä ole laskennallisen ennusteen ulottuvilla. Carragherin tiimi esimerkiksi käyttää "aikaresoluutioista" kryo-EM:ää vangitakseen nopeita konformaatiomuutoksia, joita tapahtuu proteiinien vuorovaikutuksessa muiden molekyylien kanssa. "Voimme vangita asioita ja nähdä, mitä tapahtuu sadan millisekunnin luokkaa", hän sanoo.
On myös huomattavaa jännitystä liittyvä menetelmä, kryoelektronitomografia (cryo-ET), joka vangitsee naturalistisen proteiinikäyttäytymisen jäädytettyjen solujen ohuissa osissa. Mutta näiden tungosten ja monimutkaisten kuvien tulkinta on haastavaa, ja Carragher uskoo, että koneoppimismaailman laskennalliset edistysaskeleet ovat välttämättömiä. "Miten muuten aiomme ratkaista nämä lähes ratkaisemattomat ongelmat?" hän kysyy.
Kvanttisimulaatio
Atomit ovat kooltaan atomikokoisia. Mutta oikeissa olosuhteissa ne voidaan houkutella erittäin jännittyneeseen, superkokoiseen tilaan, jonka halkaisija on yksi mikrometri tai enemmän. Suorittamalla tämän virityksen tarkasti sijoitetuille satojen atomien ryhmille hallitusti, fyysikot ovat osoittaneet, että he voivat ratkaista haastavia fysiikan ongelmia, jotka työntävät perinteiset tietokoneet äärirajoihinsa.
Kvanttitietokoneet hallitsevat tietoja kubittien muodossa. Yhdistettynä kvanttifysiikan ilmiöön, jota kutsutaan sotkeutumiseksi, kubitit voivat vaikuttaa toisiinsa etäältä. Nämä kubitit voivat lisätä rajusti laskentatehoa, joka voidaan saavuttaa tietyllä kubittien määrällä verrattuna klassisen tietokoneen vastaavaan määrään bittejä.
Kvanttilaskennan aloittaminen
Useat ryhmät ovat menestyksekkäästi käyttäneet yksittäisiä ioneja kubitteina, mutta niiden sähkövaraukset tekevät niistä haastavaa koota suurella tiheydellä. Fyysikot, kuten Antoine Browaeys Ranskan kansallisesta tutkimustoimistosta CNRS Pariisista ja Mikhail Lukin Harvardin yliopistosta Cambridgessa, Massachusettsissa, tutkivat vaihtoehtoista lähestymistapaa. Ryhmät käyttävät optisia pinsetejä kohdistaakseen tarkalleen varaamattomat atomit tiiviisti pakattuihin 2D- ja 3D-ryhmiin ja käyttävät sitten lasereita hiukkasten virittämiseksi halkaisijaltaan suuriksi "Rydberg-atomeiksi", jotka kietoutuvat naapureihinsa10 ,11. "Rydbergin atomijärjestelmät ovat yksilöllisesti ohjattavissa, ja niiden vuorovaikutus voidaan kytkeä päälle ja pois", selittää fyysikko Jaewook Ahn Korea Advanced Institute of Science and Technologysta Daejeonissa Etelä-Koreassa. Tämä puolestaan antaa ohjelmoitavuuden.
Tämä lähestymistapa on saanut huomattavaa vauhtia vain muutaman vuoden aikana tekniikan kehityksen myötä, joka on parantanut Rydbergin atomiryhmien vakautta ja suorituskykyä, sekä nopean skaalauksen muutamasta kymmenestä kubitista useisiin satoihin. Varhaiset sovellukset ovat keskittyneet määriteltyihin ongelmiin, kuten materiaalien ominaisuuksien ennustamiseen, mutta lähestymistapa on monipuolinen. "Toistaiseksi mikä tahansa teoreettinen malli, jonka teoreetikot ovat keksineet, on ollut tapa toteuttaa se", Browaeys sanoo.
Alan edelläkävijät ovat perustaneet yrityksiä, jotka kehittävät Rydbergin atomijoukkopohjaisia järjestelmiä laboratoriokäyttöön, ja Browaeys arvioi, että tällaisia kvanttisimulaattoreita voisi olla kaupallisesti saatavilla vuoden tai kahden kuluttua. Mutta tämä työ voisi myös tasoittaa tietä kvanttitietokoneille, joita voidaan soveltaa yleisemmin, mukaan lukien taloustiede, logistiikka ja salaus. Tutkijat kamppailevat edelleen määrittääkseen tämän vielä syntymässä olevan tekniikan paikan tietojenkäsittelymaailmassa, mutta Ahn vetää rinnastuksia Wrightin veljien varhaiseen ilmailuun. "Sillä ensimmäisellä lentokoneella ei ollut kuljetusetuja", Ahn sanoo, "mutta se muutti lopulta maailmaa."
Tarkka genomin manipulointi
Kaikesta genominmuokkauskyvystään huolimatta CRISPR–Cas9-tekniikka sopii paremmin geenien inaktivointiin kuin korjaamiseen. Tämä johtuu siitä, että vaikka Cas9-entsyymin kohdistaminen genomiseen sekvenssiin on suhteellisen tarkkaa, solu ei korjaa tuloksena olevaa kaksijuosteista leikkausta. CRISPR–Cas9-korjaukset, joita välittää prosessi, jota kutsutaan ei-homologiseksi päiden liittämiseksi, ovat usein mutaisia pienten lisäysten tai poistojen takia.
Useimmat geneettiset sairaudet vaativat geenien korjaamista häiriön sijaan, huomauttaa David Liu, kemian biologi Harvardin yliopistosta Cambridgessa. Liu ja hänen tiiminsä ovat kehittäneet kaksi lupaavaa lähestymistapaa tehdäkseen juuri sen. Molemmat hyödyntävät CRISPR:n tarkkaa kohdistusta ja rajoittavat samalla Cas9:n kykyä leikata DNA:ta kyseisessä paikassa. Ensimmäinen, nimeltään emäsmuokkaus, yhdistää Cas9:n katalyyttisesti heikentyneen muodon entsyymiin, joka auttaa nukleotidin kemiallista muuntamista toiseksi – esimerkiksi sytosiinin tymiiniksi tai adeniinin guaniiniksi (katso Nature https://doi.org/hc2t; 2016). Mutta tällä menetelmällä voidaan tällä hetkellä käyttää vain tiettyjä kalustosta toiseen muutoksia. Ensisijainen editointi, tiimin uudempi kehitys, yhdistää Cas9:n entsyymiin, joka tunnetaan nimellä käänteistranskriptaasi, ja käyttää ohjaavaa RNA:ta, joka on modifioitu sisältämään haluttu muokkaus genomisekvenssiin (katso Nature 574, 464– 465; 2019). Monivaiheisen biokemiallisen prosessin kautta nämä komponentit kopioivat ohjaavan RNA:n DNA:han, joka lopulta korvaa kohdegenomisekvenssin. Tärkeää on, että sekä perus- että perusmuokkaus katkaisee vain yhden DNA-juosteen, mikä on turvallisempi ja vähemmän häiritsevä prosessi soluille.
Uusi supertarkka CRISPR-työkalu voi torjua monia geneettisiä sairauksia
Ensimmäisen kerran vuonna 2016 kuvattu perusmuokkaus on jo matkalla klinikalle: Liun perustama Beam Therapeutics, jonka perustaja on myös Cambridgessa, sai marraskuussa Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirastolta neuvon kokeilla tätä lähestymistapaa ihmisillä. ensimmäistä kertaa, tavoitteena korjata sirppisolusairautta aiheuttava geeni.
Prime-editointi ei ole niin pitkällä, mutta parannettuja iteraatioita tulee jatkuvasti esiin, ja menetelmän lupaus on selvä. Hyongbum Henry Kim, genomin muokkaamisen asiantuntija Yonsein yliopiston lääketieteellisestä korkeakoulusta Soulissa, ja hänen tiiminsä ovat osoittaneet, että he voivat saavuttaa jopa 16 % tehokkuuden käyttämällä prime editointia verkkokalvon geenimutaatioiden korjaamiseksi hiirissä12 . "Jos käyttäisimme äskettäin raportoituja, edistyneempiä versioita, tehokkuus paranisi vielä enemmän", hän sanoo. Ja Liun ryhmä on havainnut, että ensisijainen koneisto voi auttaa geenikokoisten DNA-sekvenssien liittämisessä genomiin, mikä voi tarjota turvallisemman, tiukemmin kontrolloidun strategian geeniterapiaan13. Prosessi on suhteellisen tehoton, mutta pienelläkin korjauksella voi joskus päästä pitkälle, Liu huomauttaa. "Joissakin tapauksissa tiedetään, että jos voit korvata geenin 10 tai jopa 1 prosentin tasolla, voit pelastaa taudin", hän sanoo.
Kohdennetut geeniterapiat
Nukleiinihappopohjaisilla lääkkeillä saattaa olla vaikutusta klinikalla, mutta ne ovat edelleen suurelta osin rajallisia niiden kudosten suhteen, joissa niitä voidaan käyttää. sovelletaan. Useimmat hoidot vaativat joko paikallista antoa tai ex vivo -käsittelyä soluille, jotka kerätään ja siirretään sitten takaisin potilaaseen. Eräs merkittävä poikkeus on maksa, joka suodattaa verenkiertoa ja on osoittautunut vahvaksi kohteeksi valikoivalle lääkeannostelulle. Tässä tapauksessa suonensisäinen - tai jopa ihonalainen - antaminen voi saada työn tehtyä.
"Pelkästi toimituksen saaminen mihin tahansa kudokseen on vaikeaa, kun todella ajattelee haastetta", sanoo Daniel Anderson, kemianinsinööri Massachusetts Institute of Technologysta (MIT) Cambridgesta. "Kehomme on suunniteltu käyttämään olemassa olevaa geneettistä tietoa, ei ottamaan vastaan uusia tulokkaita." Mutta tutkijat edistyvät tasaisesti sellaisten strategioiden kehittämisessä, jotka voivat auttaa paimentamaan näitä lääkkeitä tiettyihin elinjärjestelmiin samalla kun säästetään muita, ei-kohdekudoksia.
Adenoon liittyvät virukset ovat valinta monissa geeniterapiatoimissa, ja eläintutkimukset ovat osoittaneet, että oikean viruksen huolellinen valinta yhdistettynä kudosspesifisiin geenipromoottoreihin voi saavuttaa tehokkaan, elinrajoitetun toimituksen14 . Virukset ovat kuitenkin joskus haastavia valmistaa mittakaavassa, ja ne voivat saada aikaan immuunivasteita, jotka heikentävät tehoa tai aiheuttavat haittavaikutuksia.
Lipidinanohiukkaset tarjoavat ei-viruksen vaihtoehdon, ja useat viime vuosien aikana julkaistut tutkimukset korostavat mahdollisuuksia säätää niiden spesifisyyttä. Esimerkiksi biokemisti Daniel Siegwartin ja hänen kollegoidensa Texasin yliopiston Southwestern Medical Centerissä Dallasissa kehittämä selektiivinen organisointimenetelmä (SORT) mahdollistaa lipidinanohiukkasten nopean generoinnin ja seulonnan, jotta voidaan tunnistaa ne, jotka voivat kohdistaa soluihin tehokkaasti esimerkiksi kudoksissa. kuten keuhkot tai perna15. "Se oli yksi ensimmäisistä tutkimuksista, jotka osoittivat, että jos teet systemaattisen seulonnan näille lipidinanohiukkasille ja alat muuttaa niiden koostumusta, voit vääristää biologista jakautumista", sanoo Eindhovenin teknillisen yliopiston biolääketieteen insinööri Roy van der Meel. Alankomaat. Useat ryhmät tutkivat myös, kuinka proteiinikomponentit, kuten soluspesifiset vasta-aineet, voivat auttaa kohdentamisprosessia, Anderson huomauttaa.
Anderson on erityisen innoissaan prekliinisestä edistymisestä veren ja immuunisolujen esiasteiden kohdistamisessa luuytimessä, jonka ovat osoittaneet yritykset, kuten Beam Therapeutics ja Intellia Cambridgessa, jotka molemmat käyttävät erityisesti suunniteltuja lipidinanohiukkasten formulaatioita. Hänen mukaansa onnistuminen näiden kudosten kohdistamisessa voisi säästää potilaat uuvuttavalta prosessilta, joka liittyy nykyisiin ex vivo -geenihoitoihin, joihin kuuluu kemoterapia olemassa olevan luuytimen tappamiseksi ennen elinsiirtoa. "Näiden tekeminen in vivo voi todella muuttaa potilaiden hoitoa", Anderson sanoo.
Avaruusmultiomiikka
Yksisoluisen omiikkakehityksen räjähdysmäinen kehitys tarkoittaa, että tutkijat voivat nyt rutiininomaisesti saada geneettisiä, transkriptomisia, epigeneettisiä ja proteomisia oivalluksia yksittäisistä soluista – joskus samanaikaisesti (katso go.nature.com/3nnhooo). Mutta yksisolutekniikat uhraavat myös ratkaisevan tiedon repimällä nämä solut pois alkuperäisestä ympäristöstään.
Vuonna 2016 Joakim Lundebergin johtamat tutkijat KTH:n kuninkaallisesta teknologiainstituutista Tukholmassa kehittivät strategian tämän ongelman ratkaisemiseksi. Ryhmä valmisteli objektilasit viivakoodatuilla oligonukleotideillä - lyhyillä RNA- tai DNA-säikeillä - jotka voivat siepata lähetti-RNA:ta ehjästä kudosviipaleesta siten, että jokainen transkripti voidaan osoittaa tiettyyn kohtaan näytteessä sen viivakoodin mukaan. "Kukaan ei todellakaan uskonut, että voisimme vetää transkription laajuisen analyysin kudososastosta", Lundeberg sanoo. "Mutta se osoittautui yllättävän helpoksi."
Avaruustranskriptomiikan ala on sittemmin kasvanut räjähdysmäisesti. Useita kaupallisia järjestelmiä on nyt saatavilla, mukaan lukien 10x Genomicsin Visium Spatial Gene Expression -alusta, joka perustuu Lundebergin teknologiaan. Akateemiset ryhmät kehittävät edelleen innovatiivisia menetelmiä, jotka voivat kartoittaa geenien ilmentymistä jatkuvasti kasvavalla syvyydellä ja avaruustarkkuudella.
Nyt tutkijat kerrostavat uusia omittaisia oivalluksia tilakarttojensa päälle. Esimerkiksi biolääketieteen insinööri Rong Fan Yalen yliopistosta New Havenissa, Connecticutissa, kehitti alustan, joka tunnetaan nimellä DBiT-seq16, joka käyttää mikrofluidijärjestelmää, joka voi tuottaa samanaikaisesti viivakoodeja tuhansille mRNA-transkripteille ja sadoille mRNA-transkripteille. proteiineista, jotka on leimattu oligonukleotideilla merkityillä vasta-aineilla. Tämä voi tarjota paljon tarkemman arvion siitä, kuinka solujen geeniekspressio vaikuttaa proteiinien tuotantoon ja aktiivisuuteen, kuin voidaan saada pelkästään transkriptiotiedoista, ja Fanin tiimi on käyttänyt sitä tutkiessaan prosesseja, kuten immuunisolujen aktivaatiota. "Näemme varhaisia merkkejä siitä, kuinka ihon immuunisolut reagoivat Moderna COVID-19 -rokotteeseen", hän sanoo. Jotkut kaupalliset järjestelmät voivat myös kaapata spatiaalisia tietoja useista proteiineista rinnakkain transkriptomisten näkemysten kanssa, mukaan lukien Visium-alusta ja Nanostringin GeoMx-järjestelmä.
Sillä välin Lundebergin ryhmä on hionut spatiaalista transkriptomiikan menetelmäään siepatakseen samanaikaisesti DNA-sekvenssitietoja. Tämä on antanut hänen tiimilleen mahdollisuuden alkaa kartoittaa tuumorigeneesin taustalla olevia spatiotemporaalisia tapahtumia. "Voimme seurata näitä geneettisiä muutoksia avaruudessa, kuinka ne kehittyvät ylimääräisiksi geneettisiksi varianteiksi, jotka lopulta johtavat kasvaimeen", hän sanoo.
Fanin tiimi on osoittanut kromatiinimuutosten spatiaalista kartoitusta kudosnäytteissä, mikä voi paljastaa solugeenien säätelymaisemat, jotka vaikuttavat prosesseihin, kuten kehitykseen, erilaistumiseen ja solujen väliseen viestintään17. Fan on varma, että menetelmä voidaan yhdistää RNA:n ja jopa proteiinien spatiaaliseen analyysiin. "Meillä on alustavia tietoja, jotka osoittavat, että tämä on täysin mahdollista", hän sanoo.
CRISPR-pohjainen diagnostiikka
CRISPR–Cas-järjestelmän kyky pilkkoa tarkasti tiettyjä nukleiinihapposekvenssejä johtuu sen roolista bakteerien "immuunijärjestelmänä" virusinfektioita vastaan. Tämä linkki inspiroi tekniikan varhaisia käyttäjiä pohtimaan järjestelmän soveltuvuutta virusdiagnostiikkaan. "On vain erittäin järkevää käyttää luonnossa sitä, mitä ne on suunniteltu", sanoo Pardis Sabeti, geneetikko Broad Institute of MIT:stä ja Harvardista Cambridgessa. "Sinulla on miljardeja vuosia evoluutiota."
NatureTech-keskus
Mutta kaikkia Cas-entsyymejä ei luoda samanarvoisiksi. Cas9 on entsyymi CRISPR-pohjaisessa genomin manipuloinnissa, mutta suuri osa CRISPR-pohjaisen diagnostiikan työstä on käyttänyt Cas13-nimellä tunnettujen RNA-kohdistavien molekyylien perhettä, jonka molekyylibiologi Feng Zhang ja hänen tiiminsä tunnistivat ensimmäisen kerran vuonna 2016. Laaja. "Cas13 käyttää RNA-opastaan tunnistamaan RNA-kohteen emäspariutumisen avulla ja aktivoi ribonukleaasiaktiivisuuden, jota voidaan hyödyntää diagnostisena työkaluna käyttämällä reportteri-RNA:ta", selittää Jennifer Doudna Kalifornian yliopistosta Berkeleystä, joka jakoi Vuoden 2020 kemian Nobel-palkinto yhdessä Emmanuelle Charpentierin kanssa, joka työskentelee nyt Max Planckin patogeenien tiedeyksikössä Berliinissä, CRISPR-Cas9:n genominmuokkauskyvyn kehittämisestä. Tämä johtuu siitä, että Cas13 ei vain leikkaa ohjaavan RNA:n kohteena olevaa RNA:ta, vaan se suorittaa myös "kollateraalisen pilkkomisen" kaikille muille lähellä oleville RNA-molekyyleille. Monet Cas13-pohjaiset diagnostiikkamenetelmät käyttävät reportteri-RNA:ta, joka sitoo fluoresoivan tunnisteen sammuttajamolekyyliin, joka estää tätä fluoresenssia. Kun Cas13 aktivoituu viruksen RNA:n tunnistamisen jälkeen, se katkaisee reportterin ja vapauttaa fluoresoivan tunnisteen sammuttimesta muodostaen havaittavan signaalin. Jotkut virukset jättävät riittävän vahvan allekirjoituksen, jotta havaitseminen voidaan suorittaa ilman vahvistusta, mikä yksinkertaistaa hoitopisteiden diagnostiikkaa. Esimerkiksi viime tammikuussa Doudna ja Melanie Ott Gladstone Institute of Virologyssa San Franciscossa Kaliforniassa osoittivat nopean, nenäpuikkopohjaisen CRISPR-Cas13-testin SARS-CoV-2:n amplifikaatiovapaa havaitsemiseksi matkapuhelimella. kamera18.
RNA-monistusmenetelmät voivat lisätä herkkyyttä jäljitetyille virussekvensseille, ja Sabeti ja hänen kollegansa ovat kehittäneet mikrofluidijärjestelmän, joka seuloi useita patogeenejä rinnakkain käyttämällä monistettua geneettistä materiaalia vain muutamasta mikrolitrasta näytteestä19. "Tällä hetkellä meillä on määritys 21 viruksen tekemiseksi samanaikaisesti alle 10 dollarilla näytteeltä", hän sanoo. Sabeti ja hänen kollegansa ovat kehittäneet työkaluja CRISPR-pohjaiseen yli 169 ihmisen viruksen havaitsemiseen kerralla, hän lisää.
Muut Cas-entsyymit voisivat täydentää diagnostisia työkaluja, Doudna huomauttaa, mukaan lukien Cas12-proteiinit, joilla on samanlaisia ominaisuuksia kuin Cas13, mutta jotka kohdistuvat DNA:han RNA:n sijaan. Yhdessä nämä voivat havaita laajemman patogeenien kirjon tai jopa mahdollistaa muiden ei-tarttuvien sairauksien tehokkaan diagnosoinnin. "Se voisi olla erittäin hyödyllistä, jos voit tehdä sen suhteellisen nopeasti, varsinkin kun eri syövän alatyypit määrittävät tietyntyyppiset mutaatiot", Doudna sanoo.