От редактиране на гени през определяне на протеинова структура до квантово изчисление, ето седем технологии, които вероятно ще окажат влияние върху науката през следващата година.
Напълно завършени геноми
Приблизително една десета от човешкия геном остана неизследвана, когато изследователите по геномика Карън Мига от Калифорнийския университет в Санта Круз и Адам Филипи от Националния Изследователският институт за човешки геном в Бетесда, Мериленд, стартира консорциума Telomere-to-Telomere (T2T) през 2019 г. Сега този брой е спаднал до нула. В предпечат, публикуван през май миналата година, консорциумът докладва за първата последователност от край до край на човешкия геном, добавяйки близо 200 милиона нови базови двойки към широко използваната последователност на човешкия консенсусен геном, известна като GRCh38, и написвайки последната глава на проектът за човешкия геном1.
Издаден за първи път през 2013 г., GRCh38 е ценен инструмент — скеле, върху което да картографирате последователността на четенията. Но е осеян с дупки. Това до голяма степен се дължи на факта, че широко използваната технология за секвениране, разработена от Illumina, в Сан Диего, Калифорния, произвежда показания, които са точни, но кратки. Те не са достатъчно дълги, за да картографират недвусмислено силно повтарящи се геномни последователности, включително теломерите, които покриват краищата на хромозомите и центромерите, които координират разделянето на новорепликираната ДНК по време на клетъчното делене.
Технологиите за дълго четене на секвенции се оказаха променилите играта. Разработени от Pacific Biosciences в Менло Парк, Калифорния и Oxford Nanopore Technologies (ONT) в Оксфорд, Обединеното кралство, тези технологии могат да секвенират десетки или дори стотици хиляди бази в едно четене, но - поне в началото - не без грешки . По времето, когато екипът на T2T реконструира2,3 техните първи индивидуални хромозоми – X и 8 – през 2020 г., обаче, секвенирането на Pacific Biosciences беше напредна до степен, в която учените от T2T можеха да открият малки вариации в дълги участъци от повтарящи се последователности. Тези фини „пръстови отпечатъци“ направиха дълги повтарящи се сегменти от хромозома проследими и останалата част от генома бързо влезе в съответствие. Платформата ONT също така улавя много модификации на ДНК, които модулират генната експресия, и T2T успя да картографира тези „епигенетични тагове“ и в целия геном4.
Доближаване до пълен човешки геном
Разкритият геном T2T е от клетъчна линия, която съдържа два идентични комплекта хромозоми. Нормалните диплоидни човешки геноми съдържат две версии на всяка хромозома и сега изследователите работят върху стратегии за „фазиране“, които могат уверено да присвоят всяка последователност на подходящото хромозомно копие. „Вече получаваме някои доста феноменални поетапни сглобки“, казва Мига.
Тази диплоидна работа по сглобяване се извършва в сътрудничество с партньорската организация на T2T, Human Pangenome Reference Consortium, който се стреми да създаде по-представителна карта на генома, базирана на стотици донори от цял свят. „Ние се стремим да обхванем средно 97% от човешкото алелно разнообразие“, казва Ерих Джарвис, един от водещите изследователи на консорциума и генетик в университета Рокфелер в Ню Йорк. Като председател на проекта за геноми на гръбначни животни, Джарвис също се надява да използва тези пълни възможности за сглобяване на геноми, за да генерира пълни последователности за всеки вид гръбначни животни на Земята. „Мисля, че през следващите 10 години ще правим рутинно геноми от теломер до теломер“, казва той.
Решения за протеинова структура
Структурата диктува функцията. Но може да е трудно да се измери. Големите експериментални и изчислителни постижения през последните две години дадоха на изследователите допълнителни инструменти за определяне на протеинови структури с безпрецедентна скорост и разделителна способност.
Изкуственият интелект захранва прогнозите за сгъване на протеини
Алгоритъмът за предсказване на структурата AlphaFold2, разработен от дъщерното дружество на Alphabet DeepMind в Лондон, разчита на стратегии за „задълбочено обучение“, за да екстраполира формата на нагънат протеин от неговата аминокиселинна последователност5. След решителната победа на състезанието за критична оценка на протеиновата структура през 2020 г., в което изчислителните биолози изпробват директно своите алгоритми за предсказване на структурата, репутацията на AlphaFold2 – и приемането – скочи. „За някои от структурите прогнозите са почти зловещо добри“, казва Джанет Торнтън, старши учен и бивш директор на Европейския институт по биоинформатика в Хинкстън, Обединеното кралство. От публичното си пускане през юли миналата година AlphaFold2 се прилага към протеоми, за да се определят структурите на всички протеини, експресирани в хора6 и в 20 моделни организма (вижте Nature 595, 635; 2021), както и близо 440 000 протеина в базата данни Swiss-Prot, което значително увеличава броя на протеините, за които са налични данни за моделиране с висока степен на сигурност. Алгоритъмът AlphaFold също е доказал способността си да се справя с многоверижни протеинови комплекси7.
Успоредно с това, подобренията в криогенно-електронната микроскопия (крио-ЕМ) дават възможност на изследователите да решават експериментално дори най-предизвикателните протеини и комплекси. Cryo-EM сканира мигновено замразени молекули с електронен лъч, генерирайки изображения на протеините в множество ориентации, които след това могат да бъдат изчислително сглобени отново в 3D структура. През 2020 г. подобренията в крио-ЕМ хардуера и софтуера позволиха на два екипа да генерират структури с разделителна способност по-малка от 1,5 ангстрьома, улавяйки позицията на отделните атоми8,9. „Преди това се занимавахме с термина „атомна разделителна способност“ с безумие, но той беше почти атомен“, казва Бриджит Карагър, съдиректор на Центъра за електронна микроскопия Саймънс в Ню Йоркския център по структурна биология в Ню Йорк. „Това наистина е атомно.“ И въпреки че и двата екипа са използвали особено добре проучен модел на протеин, наречен апоферитин, казва Карагър, тези проучвания предполагат, че разделителната способност, близка до атома, е осъществима и за други, по-трудни цели.\
Много експериментатори, които първоначално бяха скептични към AlphaFold2, сега го виждат като ясно допълнение към експериментални методи като cryo-EM, където неговите изчислителни модели могат да помогнат при анализ на данни и реконструкция. И cryo-EM може да генерира открития, които в момента са недостъпни за изчислително прогнозиране. Екипът на Carragher, например, използва крио-ЕМ с „разрешена във времето“ за улавяне на бързи конформационни промени, които възникват, когато протеините взаимодействат с други молекули. „Можем да хванем нещата и да видим какво се случва от порядъка на сто милисекунди“, казва тя.
Съществува също така голямо вълнение около подобен метод, криоелектронна томография (cryo-ET), който улавя натуралистично поведение на протеини в тънки участъци от замразени клетки. Но интерпретацията на тези пренаселени, сложни изображения е предизвикателство и Карагър смята, че изчислителният напредък от света на машинното обучение ще бъде от съществено значение. „Как иначе ще разрешим тези почти неразрешими проблеми?“ Тя пита.
Квантова симулация
Атомите са атомни по размер. Но при правилните условия те могат да бъдат приведени в силно възбудено, свръхразмерно състояние с диаметри от порядъка на един микрометър или повече. Чрез извършване на това възбуждане върху внимателно позиционирани масиви от стотици атоми по контролиран начин, физиците демонстрираха, че могат да разрешават предизвикателни физични проблеми, които тласкат конвенционалните компютри до техните граници.
Квантовите компютри управляват данни под формата на кубити. Свързани заедно с помощта на феномена на квантовата физика, наречен заплитане, кубитите могат да си влияят един на друг от разстояние. Тези кубити могат драстично да увеличат изчислителната мощност, която може да бъде постигната с дадено разпределение на кубити спрямо еквивалентен брой битове в класически компютър.
Как да започнете с квантовите изчисления
Няколко групи успешно са използвали отделни йони като кубити, но техните електрически заряди ги правят предизвикателни за сглобяване при висока плътност. Физиците, включително Антоан Броуейс от френската национална изследователска агенция CNRS в Париж и Михаил Лукин от Харвардския университет в Кеймбридж, Масачузетс, проучват алтернативен подход. Екипите използват оптични пинсети, за да позиционират прецизно незаредени атоми в плътно опаковани 2D и 3D масиви, след което прилагат лазери, за да възбудят тези частици в „Ридбергови атоми“ с голям диаметър, които се заплитат със своите съседи10 ,11. „Атомните системи на Rydberg са индивидуално контролирани и техните взаимодействия могат да се включват и изключват“, обяснява физикът Jaewook Ahn от Корейския институт за напреднали науки и технологии в Daejeon, Южна Корея. Това от своя страна дава възможност за програмиране.
Този подход набра значителна скорост само за няколко години с технологичен напредък, който подобри стабилността и производителността на атомните масиви на Ридберг, както и бързо мащабиране от няколко десетки кубита до няколкостотин. Ранните приложения са фокусирани върху определени проблеми, като например прогнозиране на свойствата на материалите, но подходът е многостранен. „Досега всеки теоретичен модел, който теоретиците измислиха, имаше начин да бъде приложен“, казва Броуейс.
Пионерите в тази област са основали компании, които разработват базирани на Rydberg атомни масиви системи за лабораторна употреба, а Browaeys изчислява, че такива квантови симулатори могат да бъдат налични в търговската мрежа след година или две. Но тази работа може също така да проправи пътя към квантови компютри, които могат да се прилагат по-общо, включително в икономиката, логистиката и криптирането. Изследователите все още се борят да определят мястото на тази все още зараждаща се технология в компютърния свят, но Ан прави паралели с ранното навлизане на братя Райт в авиацията. „Този първи самолет нямаше никакви транспортни предимства“, казва Ан, „но в крайна сметка промени света.“
Прецизна манипулация на генома
При цялата си мощ за редактиране на генома, технологията CRISPR–Cas9 е по-подходяща за инактивиране на гени, отколкото за възстановяване. Това е така, защото въпреки че насочването на ензима Cas9 към геномна последователност е сравнително прецизно, клетъчното възстановяване на получения двуверижен разрез не е. Медиирани от процес, наречен нехомоложно свързване на краищата, поправките на CRISPR-Cas9 често са замъглени от малки вмъквания или заличавания.
Повечето генетични заболявания изискват корекция на гена, а не разрушаване, отбелязва Дейвид Лиу, химически биолог от Харвардския университет в Кеймбридж. Лиу и неговият екип са разработили два обещаващи подхода, за да направят точно това. И двете използват точното насочване на CRISPR, като същевременно ограничават способността на Cas9 да реже ДНК на това място. Първият, наречен базово редактиране, свързва каталитично увредена форма на Cas9 към ензим, който подпомага химическото превръщане на един нуклеотид в друг - например цитозин в тимин или аденин в гуанин (вижте Nature https://doi.org/hc2t; 2016). Но само определени промени от база към база в момента са достъпни чрез този метод. Основното редактиране, по-новата разработка на екипа, свързва Cas9 с вид ензим, известен като обратна транскриптаза, и използва водеща РНК, която е модифицирана, за да включва желаната редакция на геномната последователност (вижте Nature 574, 464– 465; 2019). Чрез многоетапен биохимичен процес тези компоненти копират водещата РНК в ДНК, която в крайна сметка замества целевата последователност на генома. Важно е, че както базовото, така и основното редактиране отрязват само една ДНК верига, по-безопасен и по-малко разрушителен процес за клетките.
Суперпрецизният нов инструмент CRISPR може да се справи с множество генетични заболявания
Първо описано през 2016 г., базовото редактиране вече е на път към клиниката: Beam Therapeutics, основана от Лиу и също базирана в Кеймбридж, получи одобрение през ноември от Американската администрация по храните и лекарствата да изпробва този подход при хора за за първи път с цел възстановяване на гена, който причинява сърповидно-клетъчна болест.
Основното редактиране не е толкова напреднало, но продължават да се появяват подобрени итерации и обещанието на метода е ясно. Hyongbum Henry Kim, специалист по редактиране на геном в Yonsei University College of Medicine в Сеул, и неговият екип показаха, че могат да постигнат до 16% ефективност, използвайки основно редактиране за коригиране на генни мутации на ретината при мишки12 . „Ако използвахме наскоро докладвани по-усъвършенствани версии, ефективността щеше да се подобри още повече“, казва той. И групата на Лиу е открила, че основната машина може да подпомогне вмъкването на ДНК последователности с размер на ген в генома, което потенциално предлага по-безопасна, по-строго контролирана стратегия за генна терапия13. Процесът е сравнително неефективен, но дори и малък ремонт понякога може да свърши дълъг път, отбелязва Лиу. „В някои случаи е известно, че ако можете да замените ген на ниво от 10% или дори 1%, можете да спасите болестта“, казва той.
Целеви генетични терапии
Лекарствата на основата на нуклеинова киселина може да оказват влияние в клиниката, но те все още са до голяма степен ограничени по отношение на тъканите, в които могат да бъдат използвани приложено. Повечето терапии изискват или локално приложение, или ex vivo манипулиране на клетки, които се събират и след това се трансплантират обратно в пациент. Едно видно изключение е черният дроб, който филтрира кръвния поток и се оказва стабилна цел за селективно доставяне на лекарства. В този случай интравенозното - или дори подкожното - приложение може да свърши работата.
„Само доставянето до която и да е тъкан е трудно, когато наистина мислите за предизвикателството“, казва Даниел Андерсън, инженер-химик в Масачузетския технологичен институт (MIT) в Кеймбридж. „Телата ни са проектирани да използват генетичната информация, която имаме, а не да приемат новодошли.“ Но изследователите постигат постоянен напредък в разработването на стратегии, които могат да помогнат за пренасянето на тези лекарства към специфични системи от органи, като същевременно щадят други, нецелеви тъкани.
Адено-асоциираните вируси са избраното средство за много усилия за генна терапия и проучвания върху животни показват, че внимателният подбор на правилния вирус, комбиниран с тъканно-специфични генни промотори, може да постигне ефективно, органно ограничено доставяне14 . Вирусите обаче понякога са трудни за производство в мащаб и могат да предизвикат имунни реакции, които подкопават ефикасността или предизвикват неблагоприятни събития.
Липидните наночастици предоставят невирусна алтернатива и няколко проучвания, публикувани през последните няколко години, подчертават потенциала за настройка на тяхната специфичност. Например, подходът за селективно насочване към органи (SORT), разработен от биохимика Даниел Сигварт и колегите му от Югозападния медицински център на Тексаския университет в Далас, позволява бързо генериране и скрининг на липидни наночастици за идентифициране на тези, които могат ефективно да насочват клетките в тъкани като като бял дроб или далак15. „Това беше една от първите статии, които показаха, че ако правите систематичен скрининг на тези липидни наночастици и започнете да променяте техния състав, можете да изкривите биоразпределението“, казва Рой ван дер Меел, биомедицински инженер в Технологичния университет в Айндховен в Холандия. Няколко групи също проучват как протеиновите компоненти като клетъчно-специфични антитела могат да подпомогнат процеса на насочване, отбелязва Андерсън.
Андерсън е особено развълнуван от предклиничния напредък в насочването към прекурсори на кръв и имунни клетки в костния мозък, демонстриран от компании като Beam Therapeutics и Intellia в Кеймбридж, като и двете използват специално проектирани формулировки от липидни наночастици. Успехът в насочването към тези тъкани, казва той, може да спести пациентите от изтощителния процес, свързан с настоящите ex vivo генни терапии, който включва химиотерапия за унищожаване на съществуващ костен мозък преди трансплантация. „Правенето на тези неща in vivo наистина може да промени лечението на пациентите“, казва Андерсън.
Пространствена мулти-омика
Експлозията в развитието на едноклетъчната омика означава, че изследователите вече могат рутинно да извличат генетични, транскриптомни, епигенетични и протеомни прозрения от отделни клетки — понякога едновременно (вижте go.nature.com/3nnhooo). Но техниките с една клетка също жертват важна информация, като изтръгват тези клетки от тяхната естествена среда.
През 2016 г. изследователи, ръководени от Йоаким Лундеберг от Кралския технологичен институт KTH в Стокхолм, разработиха стратегия за преодоляване на този проблем. Екипът подготви слайдове с баркодирани олигонуклеотиди - къси вериги на РНК или ДНК - които могат да уловят информационна РНК от непокътнат тъканен срез, така че всеки транскрипт да може да бъде присвоен на определена позиция в пробата според своя баркод. „Никой наистина не вярваше, че можем да извлечем анализ на целия транскриптом от тъканна секция“, казва Лундеберг. „Но се оказа изненадващо лесно.“
Полето на пространствената транскриптомика оттогава експлодира. Вече са налични множество търговски системи, включително платформата Visium Spatial Gene Expression от 10x Genomics, която се основава на технологията на Lundeberg. Академичните групи продължават да разработват иновативни методи, които могат да картографират генната експресия с непрекъснато нарастваща дълбочина и пространствена резолюция.
Сега изследователите наслояват още омични прозрения върху своите пространствени карти. Например, биомедицинският инженер Ронг Фан от Йейлския университет в Ню Хейвън, Кънектикът, разработи платформа, известна като DBiT-seq16, която използва микрофлуидна система, която може едновременно да генерира баркодове за хиляди иРНК транскрипти и стотици на протеини, белязани с маркирани с олигонуклеотиди антитела. Това може да предостави много по-точна оценка за това как клетъчната генна експресия влияе върху производството и активността на протеини, отколкото може да се получи само от транскриптомични данни, и екипът на Fan го използва, за да изследва процеси като активиране на имунни клетки. „Виждаме ранни признаци за това как имунните клетки в кожата реагират на ваксината на Moderna срещу COVID-19“, казва той. Някои търговски системи могат също да улавят пространствени данни от множество протеини паралелно с транскриптомни прозрения, включително платформата Visium и системата GeoMx на Nanostring.
Междувременно групата на Лундеберг е усъвършенствала своя метод за пространствена транскриптомия, за да улавя едновременно данни за ДНК последователности. Това позволи на екипа му да започне да картографира пространствено-времевите събития, които са в основата на туморогенезата. „Можем да проследим тези генетични промени в космоса, как те се развиват в допълнителни генетични варианти, които в крайна сметка водят до тумора“, казва той.
Екипът на Фен демонстрира пространствено картографиране на модификации на хроматин в тъканни проби, което може да разкрие регулаторните пейзажи на клетъчните гени, които влияят на процеси като развитие, диференциация и междуклетъчна комуникация17. Фен е уверен, че методът може да бъде съчетан с пространствен анализ на РНК и дори протеини. „Имаме предварителни данни, които показват, че това е напълно изпълнимо“, казва той.
Диагностика, базирана на CRISPR
Капацитетът на системата CRISPR–Cas за прецизно разцепване на специфични последователности на нуклеинова киселина произтича от нейната роля на бактериална „имунна система“ срещу вирусна инфекция. Тази връзка вдъхнови първите възприематели на технологията да обмислят приложимостта на системата за вирусна диагностика. „Просто има много смисъл да се използва това, за което са предназначени в природата“, казва Пардис Сабети, генетик в Broad Institute на MIT и Харвард в Кеймбридж. „Имате милиарди години еволюция на ваша страна.“
Център NatureTech
Но не всички Cas ензими са създадени еднакви. Cas9 е основният ензим за манипулиране на генома, базирано на CRISPR, но голяма част от работата в диагностиката, базирана на CRISPR, е използвала семейството на РНК-таргетни молекули, известни като Cas13, идентифицирани за първи път през 2016 г. от молекулярния биолог Фън Джан и неговия екип в широкият. „Cas13 използва своето РНК ръководство, за да разпознае РНК мишена чрез сдвояване на бази и активира рибонуклеазна активност, която може да се използва като диагностичен инструмент чрез използване на репортерна РНК“, обяснява Дженифър Дудна от Калифорнийския университет, Бъркли, която сподели Нобелова награда за химия за 2020 г. с Еманюел Шарпентие, сега в звеното на Макс Планк за науката за патогените в Берлин, за разработване на възможностите за редактиране на генома на CRISPR–Cas9. Това е така, защото Cas13 не просто разрязва РНК, насочена от направляващата РНК, но също така извършва „колатерално разцепване“ на всички други близки РНК молекули. Много диагностики, базирани на Cas13, използват репортерна РНК, която свързва флуоресцентен маркер към молекула на гасител, която инхибира тази флуоресценция. Когато Cas13 се активира след разпознаване на вирусна РНК, той отрязва репортера и освобождава флуоресцентния маркер от гасителя, генерирайки откриваем сигнал. Някои вируси оставят достатъчно силен подпис, така че откриването може да се постигне без усилване, което опростява диагностиката на място. Например през миналия януари Дудна и Мелани От от Института по вирусология „Гладстон“ в Сан Франциско, Калифорния, демонстрираха бърз, базиран на назален тампон CRISPR–Cas13 тест за откриване без амплификация на SARS-CoV-2 с помощта на мобилен телефон камера18.
Процедурите за РНК-амплификация могат да повишат чувствителността към следи от вирусни последователности, а Сабети и нейните колеги са разработили микрофлуидна система, която скринира за множество патогени паралелно, като използва амплифициран генетичен материал само от няколко микролитра проба19. „В момента имаме тест за извършване на 21 вируса едновременно за по-малко от 10 щатски долара на проба“, казва тя. Сабети и нейните колеги са разработили инструменти за базирано на CRISPR откриване на повече от 169 човешки вируса наведнъж, добавя тя.
Други Cas ензими биха могли да изпълнят инструментариума за диагностика, отбелязва Doudna, включително протеините Cas12, които показват подобни свойства на Cas13, но са насочени към ДНК, а не към РНК. Взети заедно, те биха могли да открият по-широк спектър от патогени или дори да позволят ефективна диагностика на други неинфекциозни заболявания. „Това може да бъде много полезно, ако можете да го направите сравнително бързо, особено когато различните подтипове рак се определят от определени видове мутации“, казва Дудна.